一代测序技术的优势及应用

@孔仪13703124146：一代测序，二代测序，三代测序的优点缺点分别是什么，求大神赐教-一代测序，二代测序，三代测序的优点缺点分别介绍如下：一代测序优点是读长较长、准确性高。缺点是测序成本高、通量低，使得denovo测序、转录组测序等应用难以普及。二代测序优点是相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内。缺点是序列读长方面比第一代测序技术要短很多。三代测序优点是读长较长，可以减少拼接成本，节省内存和计算时间。缺点是单读长的错误率偏高，需重复测序以纠错（增加测序成本）。想要了解更多有关一代测序，二代测序，三代测序的相关信息，推荐咨询海普洛斯。旗下医学检验实验室具有国际顶尖基因测序平台以及完善的国际标准质量体系，通过CAP(美国病理学家协会)/EMQN(欧洲分子基因诊断质量联盟)/中国卫生部临检中心等权威认证，业务覆盖肿瘤全病程管理、遗传性疾病筛查、重大感染性疾病（含新冠核酸）等领域，已为全国500多家三甲医院、数百家科研院所、体检机构、保险公司、互联网平台以及各地政府提供基因检测技术服务和整体解决方案。【●没病有必要做基因检测吗？过来人有话说......】

@蒋婕15183534010：科普讲堂|一代、二代、三代基因测序技术大对比-测序技术是基因组学的核心技术，是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。今天我来简单盘点一代、二代、三代测序技术的优劣势及应用情况。一代测序是上世纪70年代由Sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，也称为Sanger测序。在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长共计5375个碱基。2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。Sanger测序原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。一代测序虽然准确度十分高，且该技术在当下依然被广泛应用（比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到），但是通量太低，所以对于大片段或者全外显子等非常耗时，且很多情况下成本较高。二代测序技术，又称为NextGenerationSequencing（NGS）技术，是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。刚面世时主要包括Roche公司的454技术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测序的通量，大大降低了测序成本和周期。其中Illumina公司凭借超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测序公司，其测序成本近五年来从几千元1G（1G即10亿碱基）降到了到今天的40多块钱1G数据量，这个过程中基因组Denovo测序、转录组测序、小RNA测序、LncRNA测序、circRNA测序、DNA甲基化测序、高密度遗传图谱、大规模GWAS关联分析等等实验手段得到了广泛的推广应用。近年来，NGS技术发展迅速，其应用已进展至临床检测，如无创产前、遗传性疾病，肿瘤（实体/血液）等。Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像。主要步骤：1、DNA文库制备——超声打断加接头；2、Flowcell——吸附流动DNA片段；3、桥式PCR扩增与变性——放大信号；4、测序——测序碱基转化为光学信号。二代测序技术虽然通量很高，成本低廉，但是读长实在太短，主流的Illumina测序仪，常规模式只能测PE150的长度，靠着软件算法上的进步才得以可用。由此三代测序走上了历史舞台。三代测序主要有两种技术：PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies的纳米孔单分子测序技术，这两种技术的测序读长都可以达到几十kb的级别，远远高于二代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。实现了对每一条DNA分子的单独测序。单分子测序可以更准确地检测串联重复扩增等。这对于无参物种的分子生物学研究大有帮助，长读长对于基因组拼接、全长基因序列的获取提供了巨大的便利。PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统（SingleMoleculeRealTime，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：1、聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部；2、4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部；3、荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光；4、荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基；5、统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列；6、酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落；7、聚合反应持续进行，测序同时持续进行。但是三代仍然不是完美的技术，其测序错误率相对于一代和二代还是高了很多，另外通量还是远低于二代测序，导致成本也是数倍于二代测序。胡润|文案

@杨瑶15230200783：新一代测序技术-第一代测序技术以“Sanger法”为代表，实现了测序技术从无到有的飞跃，人们借助其完成了“人类基因组草图”，以及动植物、微生物等模式生物的基因组测序。一代测序经发展实现了自动化，但总体而言通量低、流程长、成本高，难以商业化。新测序技术以不可抵挡的势头发展起来。新一代测序技术（next-generationsequencing,NGS）的起点是2005年以来Roche454、IlluminaGA/HiSeq、LifeSOLiD/IonTorrent、PacBioRS技术的发明，新技术使测序通量快速增加，测序成本极大降低。本文主要介绍Illumina测序技术、PacificBioSciencesSMRTRS测序技术、Oxford纳米孔测序技术及华大平台的DNBSEQTM测序技术。该技术是目前应用最广泛的新一代基因组测序平台，它使用边合成边测序技术实现大规模平行测序。它最早是由Solexa公司开发，所以也称为Solexa测序技术。Illumina测序平台有多种仪器选择，如超大通量、适合测序中心和测序公司的HiSeq系列测序仪，也有适合中小型实验室测序和医院医疗诊断测序使用的MiSeq和NextSeq500测序仪，也有专门用于医疗诊断测序用的MiniSeq等。测序模式分为高通量模式与快速模式。其中，高通量模式可兼容更多的样本量及应用种类；而快速模式测序速度更快、单次运行成本更低。Solexa测序技术的原理网友“星空Idealist”在“知乎”、“Z_Y_H”在“”等平台做过详细介绍：（第二代测序原理的详细解析！-星空Idealist的文章-知乎）；（illumina双端测序-Z_Y_H的文章-）。下面只做简单概括。该方法的第一步是建立测序文库（sequencinglibrarypreparation）（图1）。基因组打碎成小片段，双端补齐，3’加A尾，添加Illumina专用接头（一端有oligoT），该接头含有一个酶切位点，且为环状非互补链，故形成一个“球形”接头。当用限制酶进行切割后，形成“Y形”末端，从而能按部就班逐链复制。在双链末端加入与后续扩增引物互补的片段（通过两次复制实现，所加两端引物序列不同，设为P5、P7），以及在引物内侧加入标记（barcode）（所加两端标记不同），如有需要可用Taq酶补齐至平末端。做好以上工作，需行纯化，仅将正确添加接头的序列用于后续反应，去除引物、酶等杂质。以上操作可一次性对整个文库进行。提纯后进行文库的扩增成簇过程（clustergeneration），该过程的目的是为使测序信号放大。经变性的测序文库在有八个泳道（lane）的芯片（flowcell）上，与固化在泳道玻片壁上的寡核苷酸特异性互补结合（P5’、P7’），经一轮复制（5’->3’），模板被切断并洗掉，固定在芯片的寡核苷酸合成为互补链。然后开始桥式扩增（bridgeamplification）把带有待测DNA片段的文库扩增到1000个拷贝左右，每个拷贝都有相同的DNA序列，这样就形成了簇（cluster）。最后一次扩增产物变性为单链，这些单链可用来双端测序（paired-endsequencing），但通常的做法是利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）的8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）选择性切断作用，选择性将正向或反向序列从接头处切去，避免因链间距过近对序列添加的影响。若先切去反向序列，则测完后，再重复前述反应至选择性切割时，切去正向序列，进行反向测序即可。第三步是测序过程。Illumina平台使用SBS技术和3’端可逆屏蔽终结子技术（3’-blockedreversibleterminator）进行测序。3’端可逆屏蔽终结子技术利用有荧光标记的特殊核苷酸，这种核苷酸的3’羟基被化学基团屏蔽，导致每次DNA链合成都只能加入一个核苷酸，但当荧光图像记录完后，该化学屏蔽基团便通过酶切方法切掉，3’端恢复连接能力，如此周而复始。可以想象，由于起初变性文库中包含模板-互补链（二者的标记没有区别），在一次过程中同时被测序，因此在收集单向测序（singlereadsequencing）结果时需进行互补链识别，以免序列拼接发生混乱。正反双端测序，极大提高了测序效率。由于Illumina测序技术使用扩增成簇的信号放大原理，使其读长无法达到一代测序水平，因为当扩增至数百碱基后，受核苷酸浓度、酶活等影响，簇内碱基添加将不再同步，不同步则信号混乱，导致读序不准。该技术是PacificBioSciences推出的单分子实时（singlemolecularrealtime）DNA测序技术，基于边合成边测序原理。该技术主要特点是读长长，平均序列在10kb以上，最长读长可达40kb。它以SMRTCell为测序载体，SMRTCell是一张厚度为100nm的金属片，一面带有15万个（2014年）直径为几十纳米的小孔，称为零模波导（zero-modewaveguide,ZMW），也称纳米孔。测序时，系统将测序文库、DNA聚合酶和带有不同荧光标记的dDNA放置到纳米孔底部进行DNA合成反应。通常一个纳米孔固定一个DNA聚合酶Fenix和一条DNA模板。该方法的特别之处在于测序文库不需要扩增，因为零模波导能极大消除噪音荧光背景，而使单分子反应释放的荧光也能被准确记录。此外，SMRT技术用于检测标记的荧光基团与脱氧核苷酸的结合位置不是在碱基上，而是在5’磷酸基团的第3个磷酸基上，这样在dNTP于测序模板互补结合到测序引物上发生缩合反应后，荧光基团就随焦磷酸一起被切掉了，省去酶切步骤。2014年OxfordNanopore公司推出了几款基于纳米孔测序技术的测序仪MinION、PromenthION、GridION。其基本原理为：在充满了电解液的纳米级小孔两端加上一定的电压，可以很容易地测量通过此纳米孔的电流强度。纳米孔的直径只能容纳一个核苷酸通过，当核苷酸通过时，纳米孔被核苷酸阻断，通过的电流强度随之变弱。由于四种核苷酸碱基的空间构象不同，它们在通过纳米孔时，被减弱的电流强度变化程度也就有所不同。因此，只需检测DNA通过纳米孔时检测电流强度的变化，即可实现实时测序。该法亦无需文库扩增，读长长，实时，单分子，可以极大降低测序成本。该技术起源于CompleteGenomics，改进于华大。下面根据华大官网文章简要说明该方法的原理。按照图2的流程，华大基因使用DNA纳米球技术来扩增DNA序列，在该技术中，DNA被分割成约100碱基对的片段。该片段的每一侧与第一种接头，即接头1连接。连接后的DNA片段被扩增，通过将两端的接头结合而形成环状连接的序列片段。该环状DNA片段被切割以加入第二种衔接子，即接头2，并重复扩增和环化过程。一旦将四种接头，即接头1,2,3和4（四种接头的序列不同，有些是与引物互补的寡核苷酸，有些是标记物等）加入到DNA片段中，则通过滚环扩增最后的环状DNA以产生DNA纳米球（DNAnanoball,DNB）。滚球扩增时不切断各拷贝，而利用某种方法使扩增后变性但又不影响延伸，得到一团多拷贝的纳米球。将纳米球固定在芯片上的网状小孔内。测序使用联合探针锚定聚合技术（combinatorialprobe-anchorligationsequencing,cPAS）和多重置换扩增的双末端测序法（MDA-PE）增加测序读长，可测得100bp/150bp的双端序列。目前为止，并没有对联合探针锚定聚合技术的详细披露。MDA-P的具体原理是：经复制延伸完成第一链（ForwardStrand）的测序后，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，除去第一链模板同时合成第二链（ReverseStrand），并通过DNA分子锚，进行第二链的测序。与其他二代测序相比，DNBSEQTM测序技术基于DNB，DNB以最初模板扩增，不同于PCR的指数增长，最重要的是其不会使扩增过程中产生的错误累积。[1]陈浩峰.新一代基因组测序技术[M].第一版.北京:科学出版社,2016.[2]第二代测序原理的详细解析！-星空Idealist的文章-知乎.[3]illumina双端测序-Z_Y_H的文章-.[4]华大科技-产品服务-全外显子测序-产品介绍.[5]解密人类基因组：下一代测序-（一）-JingZhou的文章-LEXOLOGY.

@严珊18891515846：与一代、二代测序相比,单分子测序技术的优势是什么?并简述原因?-与一代、二代测序相比,单分子测序技术的优势：由于单分子测序具有通量更高，仪器和试剂相对便宜、操作简单等的优势而比第二代测序技术有更广阔的应用空间。第一代指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少。第二代为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。

利用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链，在三维空间中记录模板位置和核苷酸序列信息，再反向构建DNA模板的序列。除了DNA合成反应的三大要素（模板、酶、核苷酸）之外，模板所处位置和反应循环中单色荧光标记的核苷酸顺序(如A、C、G、T)也是最终DNA序列能够完成的关键要素。如果反应所用的核苷酸标记着四种不同的荧光，则每一次反应循环就需要切换不同波长的光以记录不同的碱基。以上内容参考：百度百科-单分子测序

@魏文倩18693608286：相比一代测序技术，二代测序技术具有哪些优点-相比一代测序技术，二代测序技术优点如下：1、Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像优势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。2、Roche454：油包水PCR+4种dNTP车轮大战+检测焦磷酸水解发光优势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp。3、IonTorrent原理：油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测优势：IonTorrent与454相比，主要差异在测序中，IonTorrent不需要昂贵的物理成像设备，成本相对较低体积较小，同时操作更为简单，整个上机测序可在2-3.5小时内完成（文库构建时间除外）。想要了解更多有关一代测序技术，二代测序技术的相关信息，推荐咨询海普洛斯。海普洛斯是一支由从事医学、基因组学、分子生物学、生物信息学、计算生物学、机器学习、大数据挖掘等研究的年轻海归科学家和国内顶尖科技人才组成的团队。海普洛斯的信息团队开发了完整的单分子编码数据分析技术，基于该技术，可以去除测序中产生的超过99.9%的假阳性，因此可以更佳有效地检测癌症中的单碱基突变，拷贝数变异，蛋白表达异常以及基因融合等关键信息。【●没病有必要做基因检测吗？过来人有话说......】

@沈燕13809651614：一代测序技术包括哪些？-包括Sanger测序，STR亲子鉴定、法医鉴定，SnaPshot测序技术，实时荧光定量PCR。上个世纪末90年代，与“曼哈顿原子弹计划”和“阿波罗登月计划”具有同样划时代意义的“人类基因组计划”启动，这是人类第一次在分子水平上全面地认识自我。随着人类基因组计划的开展，人们对基因与疾病的关系认识更加深入，有机会通过对基因缺陷的检测分析来判断各种疾病发生的风险，并由此衍生出一种新的健康服务项目—基因测序。Sanger测序经过38年的发展已相当完善，成本也降低了10倍以上，现在国际上仍然是基因测序行业的金标准和主力军。sanger测序是目前所有基因测序的国际金标准，是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。2010年以来，出现了很多新一代测序仪产品，新一代测序成本低、数据大、速度快，但都有待成熟，准确度不够高。（一）、Sanger测序被检测的DNA碱基顺序依次读出800bp以上，是一代所有测序和新一代所有测序的金标准。代表仪器美国ABI3730XL，Sanger测序一般医院很少开展，开展的都发公司做。耗时长达13年之久的人类基因组计划也是依靠Sanger测序法才得以最终完成的。Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR扩增直接测序。单个突变点的扩增（包括该位点在内的外显子部分片段的扩增），不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。所以单基因或部分基因控制的疾病样本检测，Sanger测序可以发挥精准和成本低的优势。（二）、STR亲子鉴定、法医鉴定通过测定DNA片段的长度和颜色，来确定遗传关系。是sanger测序技术基础上，发展起来的一个技术，所用仪器与sanger测序所用仪器一样，检测原理一样，一台设备装两套检测软件，一台仪器具有三个功能。代表仪器美国ABI3130、3130XL、3730仪器，一般司法机构和sanger测序公司拥有该仪器，医院没有。亲子鉴定就是通过对DNA遗传片段检测，判定父母与子女之间的亲缘关系。（三）、SnaPshot测序技术SNaPshot技术是美国应用生物公司（ABI）开发，是荧光标记单碱基延伸的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP突变分型项目检测。通常用于10~30个SNP突变位点分析。是sanger测序技术基础上，发展起来的一个技术，和sanger测序仪器一样，检测原理一样，一台设备装有两套检测软件，一台仪器具有三个功能。代表仪器美国ABI3130、3130XL、3730仪器，一般sanger测序公司拥该有仪器。优势：1、分型准确，2、通量高，3、检测速度快，4、不受SNP位点多态性特性限制，5、不受样本个数限制。SNaPshot技术是新一代测序技术（包括二代测序和芯片测序）SNP突变检测的金标准，sanger测序技术又是SNaPshot技术突变检测的金标准。（四）、实时荧光定量PCR利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线（或者与内参对照）对未知模板进行定量分析。代表仪器美国ABI7500荧光定量PCR仪等，一般三甲医院都有该类仪器，普及较好。使用方便维护简单。1、突变寻找：定量PCRTaqMan探针杂交。2、基因定量：相对荧光定量PCR，医学上用来检测细菌或病毒RNA的表达量。荧光定量PCR是1996年由美国ABI公司推出的一种新定量实验技术。实时荧光定量PCR应用领域：临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价，地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测，肿瘤标志物及瘤基因测序，遗传基因测序。

@吴纨18867713464：简述第一代测序技术,第二代测序技术,第三代测序技术的特点是什么?-在测序市场中，一代测序因其准确度高，仍作为突变检测、单菌鉴定等的金标准而存在。以illuminaHiSeq和MiSeq为代表的二代测序势头强劲，主打低成本和高通量，2017新机型NovaSeq更宣称已将测序成本降至百美金。科研市场上三代测序最常见的莫过于PacBio，辅以冉冉上升的新星Nanopore等，主打长读长策略，直击二代测序碎片化序列的软肋，在基因组denovo上表现不俗，错误率较高，但可被矫正。

@潘祖香13038652490：一二三代测序技术总结-1、第一代测序技术概述：用的是1975年由Sanger和Coulson开创的链终止法或者是1976-1977年由Maxam和Gilbert发明的化学法（链降解）。发展：除了Sanger测序技术，还出现了如连接酶测序和焦磷酸法测序，其中，连接酶测序是ABI公司SOLiD技术的测序基础，焦磷酸测序是Roche公司454技术的测序基础。这两者的核心思想都利用了Sanger测序技术可中断DNA合成反应的dNTP。特点：（1）平均测序长度大约为250个碱基，准确率较高；（2）可直接测未克隆的DNA片段，不需要酶催化反应；（3）适合测定含有5-甲基腺嘌呤，G+C含量较高的特殊DNA片段以及短链核苷酸的序列。缺点：测序成本高，通量低，速度慢。2、第二代测序技术概述：有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa/HiSeq技术和ABI公司的SOLiD技术。目前，Illumina的测序仪占全球75%以上的市场份额，以HiSeq系列为主。Illumina的及其采用的都是边合成边测序的方法。步骤;（1）构建DNA测序文库-超声打断加接头（2）测序流动槽-吸附流动DNA片段（3）桥式PCR扩增与变性-放大信号（4）测序-测序碱基转化为光学信号特点：（1）测序速度较第一代，测序成本较第一代低，并且保持了高准确度；（2）测序读段较短，比第一代测序技术的读段要短很多，大多只有100bp~150bp；3、第三代测序技术概述：以PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore公司的纳米孔单分子测序技术为标志。特点：（1）与前两代相比，第三代测序技术是单分子测序；（2）测序过程无须进行PCR扩增（3）具有超长读段，平均可达到10kbp~15kbp，测序过程中这些序列的读段长度是不相等的。

@赵文涛15134191282：DNA的1代测序，2代测序，3代测序的区别是什么啊？-第一代测序：指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少。第二代测序：为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。第三代测序：特点是单分子测序，多基于纳米科技，无需扩增，对单分链DNA/RNA直接用合成、降解、通过纳米孔等方式直接测序，核心特点是无需扩增所以成本更低。

扩展资料：DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。在基础生物学研究中，和在众多的应用领域，如诊断，生物技术，法医生物学，生物系统学中，DNA序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。参考资料：百度百科-DNA测序

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