分子生物学实验(分子生物学实验有多难)

现在为大家分享分子生物学实验的一些知识点，和分子生物学实验有多难的问题解析，展开分析有以下几条：

一、分子生物学鉴定步骤

1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过*的EP管中，再加*（30-40%）进行保种。（-80摄氏度保藏2年）

（1）取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。

（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。

（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。

（4）加入50ul5mol/LNaCl溶液，*混匀，再加入50ulCTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。

（6）冷却后加入等体积的*(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强*的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。

（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用）

（8）加入0.6倍体积的异*，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。

（9）向离心管中加入75%*，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。

（10）加入50ul（双蒸水）/TEBuffer溶解DNA于4℃保存。

6、PCR扩增：（*的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA进行PCR扩增，电泳*扩增得到的16SrDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）

7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳*酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。

8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16SrDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。

9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上*的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定（1000-2000bp）。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。

10、测序：将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。

11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。

12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，*将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树

二、分子生物学实验技术实验原理的目的

1、从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。

2、分子生物学中最基本的技术是蛋白质的表达和纯化。首先是编码目的蛋白的DNA序列被克隆（用PCR技术和限制性内切酶）到作为表达载体的质粒中。随后构建好的质粒被引入到宿主细胞。编码序列在质粒上的特殊的启动子元件的驱动下，被宿主细胞的表达系统所表达。质粒上通常还带有*抗性标签以便于质粒筛选。

3、质粒可以被插入到*或动物细胞。外源DNA被引入*被称为转化，可以通过电穿孔法、微注射法、正吸收和融合来实现；外源DNA被引入真核细胞，如动物细胞，被称为转染，转染技术包括磷酸钙法、脂质体法和一些有*权的商用转染试剂。DNA也可以以病毒或病原菌为载体被带入宿主细胞；应用这种病毒或病菌的转染技术于细胞时，用术语来说就是“对细胞进行转导（transduce）”。

4、多聚酶链式反应(PCR)是一项用于体外复制DNA的*通用的技术。简而言之，PCR技术可以使单链DNA被复制数百万次，也允许用事先确定好的方式对被复制的DNA序列进行改动。例如，PCR技术可以用于引入限制性酶切位点，或者对特定的DNA碱基进行突变（改变）。PCR技术还可以用于从cDNA文库获得特定的DNA片断，或者从另一个角度，用于判断一个cDNA文库中是否含有特定的DNA片断。

5、凝胶电泳是分子生物学最主要的一项技术。其基本原理是：DNA、RNA和蛋白质可以用电场来进行分离。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA和RNA可以被琼脂糖凝胶按其分子大小进行分离。同样，蛋白质可以被SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按分子量大小分离；此外，蛋白质还可以由于所带电荷的不同被等电聚焦电泳分离。

三、分子生物学实验有多难

1、对于分子生物学我个人觉得还是理论课比较重要的，而且我们老师之前就说过，在实验中，如果你的理论知识不够强大的话，因为分子生物都是肉眼不能看见的变化过程，一般结果都是只有*才能知道，也就是说，你耗时很久很久做完实验发现之前不知道哪*做错了，*功亏一篑，这时候如果你还不知道理论方面的知识，那么基本上连哪*做错都不知道，无法分析的话，实验还是很难继续做下去的。

2、我个人觉得，对于分子生物学实验来说，PCR技术无疑是最重要的，我的*不是纯粹的生物学，但是分子生物学是基础学科，而对于这门课来说，我们做的最重要，老师讲解的最细致的一个实验就是PCR了。

3、大概来讲解一下这个实验吧，对于我这种*，我做的是大肠杆菌的PCR，学生物的都知道PCR是什么，我就不多说了，现在实验室的主要仪器就是PCR仪，但是之前的提取过程也是很重要的，我之前做实验有一次的一个样品就是没提取好，*什么都没有，同时试样过程中的各种试剂、各种用量都非常精细，很多试剂都是无色透明的，*要细致，把各种试剂的使用量、添加顺序都按实验指导做好，中间的最核心的部分一本都是PCR仪做的，所以还好，一般也不会出什么错，之后还要跑个电泳，跑电泳还是比较简单啦，现在也有各种各样的不同的技术。

4、综合来说，分子生物实验就是*！*！要细心！这种微量又容易出现意外状况的实验*要细心，这也就是分子生物*的难点和重点了吧。

四、elisa是分子生物学实验吗

elisa又叫酶联免疫吸附测定，是一种利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量*方法，它是免疫学中的经典实验，常常用来测定很多微量物质。

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